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numéro 5

Pour éprouver cette hypothèse, nous avons entrepris d'étudier l'érythropoïèse chez le chien néphrectomisé maintenu en vie par dialyse péritonéale et avons assisté à la disparition complète des érythroblastes de la moelle osseuse à partir du 3e jour post-opératoire alors que l'érythropoïèse persist après la ligature des uretères (Fig. 2 et 3). Comme l' "intoxication urémique" est identique dans les deux groupes, l'origine toxique qui était jusque là considérée comme la cause la plus probable du défaut de l'érythropoïèse dans l'insuffisance rénale ne pouvait plus être retenue (10). D'autre part, en 1958, nous avons eu le privilège de disposer d'une importante quantité d'un extrait grossier d'urines riches en érythropoïétine.

 

Après injection de ce matériel chez un chien néphrectomisé, le taux des érythroblastes s'est maintenu dans les jours qui ont suivi l'intervention et nous avons même observé une ébauche de réticulocytose interrompue par le décès de l'animal (11) (Fig. 4).

Outre qu'elle rendait insoutenable la théorie de la "toxicité" comme cause essentielle de la sidération de l'érythropoïèse, cette expérience permettait déjà il y a 35 ans d'entrevoir une issue thérapeutique à l'anémie rénale lorsqu'on disposerait d'érythropoïétine utilisable en clinique. Des études de perfusion du rein in vitro ont confirmé son rôle dans la production de l'hormone.

 

     

Quel rôle le rein joue-t-il dans la production d'érythropoïétine ?

Comme les homogénats et les extraits de rein ne contiennent que des quantités infimes d'érythropoïétine et que in vitro la sécrétion ne s'observait seulement qu'à la suite de perfusions de sérum ou de plasma, on s'est demandé si l'hormone était élaborée telle quelle ou si le rein n'intervenait pas en modifiant un précurseur produit ailleurs. Dès 1966, de nombreuses publications du groupe de A.S. Gordon à New York font état d'un facteur rénal, le REF (renal erythropoïetic factor) mis en évidence dans une fraction mitochondriale d'un homogénat de rein de rat hypoxique, qui incubé avec du sérum normal engendre un agent érythrostimulant. Mais on n'a jamais identifié ce REF ni précisé la nature de l'hypothétique substrat et ces expériences ont été controversées. Toujours est-il que le débat au sujet de cette théorie est resté ouvert jusqu'à la démonstration par Erslev en 1974 que, contrairement à ce qui avait été avancé, le rein isolé de lapin perfusé avec un milieu dépourvu de sérum était susceptible de produire l'hormone. Enfin, la démonstration sans équivoque du siège de la production d'érythropoïétine a été apportée en 1986 par la mise en évidence de son ARNm dans le rein. Deux ans plus tard, simultanément deux groupes de chercheurs, Lacombe et coll. en France et Koury et coll. aux Etats-Unis (12.13), ont montré par hybridation in situ que l'érythropoïétine était sécrétée par des cellules péritubulaires proximales, peut-être d'origine endothéliale (Fig. 5).   

                 

 

L'érythropoïétine extrarénale. Le rôle du foie

Contrairement à ce qu'on observe chez le chien, la néphrectomie ne supprime pas complètement l'érythropoïèse chez l'homme, le rat et le lapin. Cette érythropoïèse résiduelle évoquait la production extrarénale d'érythropoïétine, d'autant plus qu'en 1959 Jacobson et coll. avaient montré que le rat soumis à une hypoxie intense immédiatement après néphrectomie, sécrétait l'hormone et avaient estimé à environ 20% la production extrarénale chez l'animal intact. En 1972 Fried établit que l'hépatectomie supprime la faible réponse érythropoïétique à l'hypoxie du rat anéphrique. Le rôle du foie est précisé par les études ingénieuses de Zanjani (1977) sur le foetus de mouton in utero (14). L'hépatectomie supprime chez celui-ci la réponse à l'anémie alors que la néphrectomie est sans effet, le passage à la production rénale se faisant au cours du 3e mois de la gestation. Enfin en 1986, l'ARNm de l'érythropoïétine est mise en évidence dans le foie de la souris anémique et un peu plus tard l'hybridation in situ précise que ce sont les cellules centrolobulaires qui sont en cause.

 

La purification tant attendue

La purification et l'étude chimique de l'érythropoïétine se sont heurtées à deux obstacles majeurs : la méthode de dosage et la source de matériel actif limitée au plasma d'animaux anémiés et aux urines de patients anémiques, car curieusement l'organe sécréteur, le rein, n'en contient pratiquement pas. En 1966 Goldwasser estimait que pour isoler 10 mg d'érythropoïétine hautement purifiée en vue d'une analyse chimique il ne fallait pas moins de 400 moutons anémiés ou de miIliers de litres d'urine de patients anémiques, riche en érythropoïétine. Dans ces conditions, il était tout à fait illusoire jusqu'au début des années 80 d'envisager qu'on puisse un jour disposer de cette hormone à des fins thérapeutiques. On ne pouvait, faute de mieux, que s'en remettre à la découverte bien improbable d'une molécule qui en aurait les propriétés. Il paraissait en effet impossible qu'on arrive à doser les centaines d'échantillons chromatographiques collectés lors des tentatives de purification à l'aide des méthodes décrites plus haut et, en cas de réussite, les quelques mg qui en résulteraient auraient tout au plus permis une analyse chimique. C'est cependant le tour de force qu'après 20 ans d'effort a réalisé le chimiste de Chicago. Goldwasser a relevé le défi et en 1977 partant de 2 400 litres d'urine de patients anémiques obtint une substance pure qui titrait 70 000 U/mg de Protéine (15).

 

C'est à partir de ce matériel qu'un dosage radioimmunologique a été réalisé, que la séquence des acides aminés a été établie ainsi que la chaîne nucléotidique correspondante. Le gène de l'érythropoïétine identifié sur le chromosome 7 a été cloné simultanément par deux équipes de chercheurs en 1985 et introduit dans les cellules de culture d'ovaire du hamster chinois, a permis la production industrielle de l'hormone et son usage clinique en 1986 (16, 17). C'est donc à E. Goldwasser qu'on est principalement redevable de l'érythropoïétine pure dont bénéficient aujourd'hui des dizaines de milliers de patients souffrant d'insuffisance rénale chronique.

 

La régulation de l'érythropoïèse

En 1957 Jacobson et coll. avancent l'hypothèse que c'est la balance des besoins et de l'apport d'oxygène aux tissus qui régit la production de l'hormone. On s'interroge encore sur la nature du tissu sensible à l'oxygène. Est-ce l'organe qui produit l'hormone ou celui-ci est-il sous la dépendance d'un centre de référence, sorte d'érythrostat ? La démonstration de la sécrétion d'érythropoïétine par le rein isolé in vitro ne répond que partiellement à la question. Dans un article paru dans "Science" en 1988, Goldberg et coll., étudiant l'effet du cobalt et du nickel sur la production d'érythropoïétine par des cultures de cellules d'hépatome humain, sont arrivés à la conclusion que le signal qui provoque l'expression du gène de l'érythropoïétine est une molécule d'hème qui se déformerait comme l'hémoglobine selon le degré d'oxygénation (18). Mais l'énigme de l'identité des cellules secrétantes et (ou) sensibles reste entière.

 

Rôle de l'hormone dans la différenciation cellulaire

 

Depuis le début des années 60 de nombreux travaux traitent du rôle de l'hormone  dans la  différenciation   et la multiplication des cellules  érythroïdes. En 1961 Filmanowicz et Gurney lors d'une ingénieuse et simple expérience montrent qu'après injection d'une dose unique d'érythropoïétine à la souris rendue polyglobulique par transfusion, dont la rate est dépourvue d'éléments érythroïdes, on voit apparaître dans celle-ci au cours des heures qui suivent l'injection, successivement des proérythroblastes puis des érythroblastes plus matures. Ensuite la vague de cellules différenciées disparaît tandis que survient dans le sang un pic de réticulocytes, à la 72e heure (fig. 6) (19). On assiste donc à l'action différenciante de l'hormone au niveau de cellules souches non identifiées.

 

A partir de 1966 l'essor des cultures de moelle de souris in vitro en milieu semi-solide va permettre de cerner à quel stade du développement des précurseurs intervient l'érythropoïétine. On constate alors qu'au début de leur maturation ils dépendent de divers facteurs et que se chargeant ensuite progressivement de récepteurs à l'érythropoïétine ils y deviennent électivement sensibles. Dès 1986, grâce à l'érythropoïétine pure marquée ce récepteur a été caractérisé et cloné et tout récemment (1993) on a même pu établir qu'une forme de polyglobulie rare, l'érythrocytose familiale, était due à une anomalie transmissible du récepteur qui est devenu hypersensible à l'hormone.

 

De la polyglobulie des hauts plateaux à l'érythrocytose familiale que de chemin parcouru. Vu des hauteurs de la biologie moléculaire, qu'il paraît lointain le mal des montagnes.

 

 

 Bibliographie

 
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